SUCCESVOL OPSCHALen VAN LAB NAAR PRODUCTIE

ComRaDes streeft naar beter opschalingstraject

Opschalen van bioprocessen is traditioneel een grote uitdaging. Complexe interacties tussen de microben en hun omgeving, en tussen microben onderling, leiden nog in vele gevallen tot een lange, dure en onzekere opschaling. Het consortium 'Computation for Rational Design' (ComRaDes) wil het opschalingstraject verbeteren. From lab to production with success. Hoe? Door te beginnen bij de grote schaal en te kijken door de 'ogen' van de organismen.

schematisch overzicht van het neerschaalproces — Schematisch overzicht van het neerschaalproces | A: Een CFD-simulatie van het productiereactorontwerp voorspelt de condities. B: Fluctuaties in bv. substraatconcentratie worden bepaald door microben te volgen in de simulatie, de zgn. levenslijnen. C: Een ‘neerschaalreactor’, bijvoorbeeld bestaande uit 2 compartimenten met verschillende condities, bootst omgevingsfluctuaties experimenteel na. D: De resultaten van het neerschaalexperiment worden gebruikt om de respons van de microbe te modelleren, bijvoorbeeld de penicillineproductiesnelheid qp. Dit model kan aan (A) worden gekoppeld om het ontwerp in silico te optimaliseren

Bioprocessen staan volop in de belangstelling: van traditionele voeding en farma tot duurzame productie van biobrandstoffen, materialen en ook bijvoorbeeld natuurlijke suikervervangers. De gemene deler tussen die uiteenlopende processen is dat een substraat, meestal een koolhydraat, al dan niet in bijzijn van zuurstof door een microbe tot product wordt omgezet. Typisch gebeurt dit middels een (fed-)batch met relatief milde condities, in een bellenkolom of een geroerd vat. Hoe kan het dat ondanks decennialange ervaring opschaling toch zo'n uitdaging blijft? Het antwoord ligt in de interactie tussen microben en hun omgeving.

EERST neerschalen, dan opschalen

Traditioneel begint de opschaling in het lab: het optimum voor onder meer pH, zuurstof- en suikerconcentraties wordt in een reactor van enkele liters bepaald. Bij de opschaling poogt men deze condities zo goed mogelijk te behouden, maar verschillen in bijvoorbeeld hydrodynamica, hydrostatische druk of verschillen in voedingscompositie tussen lab en fabriek kunnen tot opschaalproblemen leiden. Ons devies is daarom: begin met neerschalen in plaats van opschalen. Identificeer eerst de verwachte procescondities op productieschaal en vertaal deze zo goed mogelijk naar het lab, in plaats van andersom.

bekijk HET PROCES DOOR DE OGEN VAN HET ORGANISME

Een van de lastigste effecten tijdens het neerschalen is het menggedrag. Microben zullen niet-ideale menging op productieschaal ervaren als voortdurende variaties in hun omgeving, bijvoorbeeld in substraatconcentratie, waaraan ze zich continu moeten aanpassen - met mogelijke gevolgen voor hun productie.

Experimenten van de Jonge et al. met Penicillium chrysogenum, waarin glucose niet continu maar met intervallen van zes minuten werd gevoed, resulteerden in een 50% lagere penicillineproductie. Dit betreft echter een extreem geval; een interval van 6 minuten is veel langer dan de typische circulatietijd van hoogstens een minuut in een industriële reactor.

Idealiter zouden we door de 'ogen' van het organisme willen kijken om te bepalen hoe frequent en hoe sterk de waargenomen omgevingsfluctuaties zijn. Aangezien dit niet letterlijk kan, gebruiken we hiervoor simulaties. Computational Fluid Dynamics (CFD) kan worden gebruikt om de condities in de reactor te kwantificeren, en met zogenaamde Lagrangiaanse CFD kunnen de trajecten van individuele deeltjes (de microben) worden gevolgd. Dit maakt het mogelijk om zogenaamde 'levenslijnen' te registreren: de condities zoals waargenomen vanuit het perspectief van de microben.

VAN LEVENSLIJN NAAR NEERSCHAALREACTOR

In een voorloper van ComRaDes, het Hé-project, zijn dergelijke simulaties toegepast voor een industrieel penicillineproductieproces. Hierin werd bepaald hoe organismen heterogeniteit in glucoseconcentratie in de reactor ervaren (Figuur 1A, B). Om dergelijke voorspellingen te verifiëren en de microbiële respons beter te begrijpen, werden de productieschaalcondities naar het lab vertaald (Figuur 1C). Binnen het project zijn methoden ontwikkeld om het neerschaalontwerp te baseren op de levenslijnen van de microben, al zijn deze nog beperkt toegepast. Op basis van experimentele data werd vervolgens een model van het organisme ontwikkeld. Door dit model aan de CFD-simulatie te koppelen, kon ook de invloed van substraatfluctuaties op de penicillineproductie worden gekwantificeerd (Figuur 1D) - via de levenslijnen tellen de historische ervaringen van de microbe mee in het latere gedrag. In een simulatie van het initiële reactorontwerp leidde dit tot een voorspeld productieverlies van 33% ten opzichte van ideale menging; door terug te gaan naar de ontwerpstap en de voedingslocatie te optimaliseren, kon dit worden teruggebracht naar 9%, wat de potentie van deze simulaties in procesoptimalisatie laat zien.

COMPUTATION FOR RATIONAL DESIGN

ComRaDes bouwt voort op deze basis. Naast de simulaties ligt er meer nadruk op de praktische vertaling naar experimenten en het kwantificeren van de microbiële respons op verschillende niveaus: er wordt gekeken hoe lang het duurt voordat reacties in metabole, maar ook genetische regulatie zichtbaar zijn. Dit wordt - naast het eerder genoemde P. chrysogenum, geleverd door Centrient Pharmaceuticals - ook gedaan voor giststammen waarvan bekend is dat ze onder bepaalde omstandigheden ethanol produceren, iets wat niet altijd gewenst is. Deze stammen worden geleverd door DSM. Om de simultane effecten van suiker- en zuurstofvariaties te vangen, zullen geavanceerdere metabole modellen worden ontwikkeld voor beide organismen, die wederom met de CFD-simulaties worden gekoppeld.

Tot slot wordt gewerkt aan het meer realistisch simuleren van de hydrodynamica in beluchte processen. Dit onderdeel van ComRaDes wordt uitgevoerd door TU Delft, met de focus op penicilline, en Universiteit Stuttgart, waar de focus op gist ligt.

Het ComRaDes-team: een samenwerking tussen TU Delft, IBVT Stuttgart, Gembloux Agro-Biotech, Syngulon, DSM en Centrient Pharmaceuticals — Team ComRaDes: een samenwerking tussen TU Delft, IBVT Stuttgart, Gembloux Agro-Biotech, Syngulon, DSM en Centrient Pharmaceuticals

DE INVLOED VAN POPULATIEHETEROGENITEIT

Het bovenstaande richt zich op heterogeniteit in de omgeving, maar ook heterogeniteit in de populatie van microben speelt een rol. Zelfs onder ideaal gemengde condities zullen stochastische verschillen binnen microben tot een heterogene populatie leiden - dit is duidelijk zichtbaar wanneer cellen worden gemodificeerd om bij stress te fluoresceren (Figuur 2A). Deze populatieheterogeniteit kan verder worden beïnvloed door heterogeniteit in de omgeving. In een heterogene populatie zal niet iedere cel evenveel bijdragen aan de productie, maar dit effect wordt nog slecht begrepen en typisch niet in procesontwikkeling meegenomen. Binnen ComRaDes probeert het team van Gembloux Agro-Biotech met een combinatie van microreactorexperimenten en fluorescence-activated cell sorting (FACS, Figuur 2B) populatieheterogeniteit beter te begrijpen en te modelleren. Naast interactie binnen een populatie wordt ook ongewenste interactie met andere soorten - contaminatie - onderzocht. Contaminatie is in de praktijk lastig om volledig te voorkomen, en het kan een significante oorzaak van productieverliezen zijn. Een mogelijkheid om contaminatierisico's te verminderen is het robuuster maken van de organismen door het toevoegen van zogenaamde bacteriociden - stoffen die productieorganismen in staat stellen om contaminaties aan te vechten. Deze worden beschikbaar gemaakt door Syngulon, een Belgisch mkb.

Figuur 2: een voorbeeld van populatie-heterogeniteit in bakkersgist.
Links: cellen onder stress fluoresceren door het aanbrengen van een fluorescerend eiwit dat is verbonden met de stressrespons.
Rechts: FACS kan worden gebruikt om de fluorescentie (verticaal) en vorm van cellen (scatter, horizontaal) te meten – door metingen van duizenden cellen in een contourplot samen te vatten, wordt heterogeniteit in de populatie kwantitatief gevangen

DE TOEKOMST VAN NEER- EN OPSCHALING

Door beter te begrijpen hoe microben reageren op de condities die ze in een productiereactor ervaren, en hoe interacties binnen de populatie van microben de productie beïnvloeden, is het doel van ComRaDes om bioprocesontwikkeling sneller, goedkoper en betrouwbaarder te maken. Door uit te gaan van het perspectief van de individuele microben, zowel in simulaties als experimenteel, maken we uiteindelijk van de kunst van het opschalen een wetenschap.

ComRaDes is een samenwerkingsverband tussen TU Delft, IBVT Stuttgart, Gembloux Agro-Biotech, Syngulon, DSM en Centrient Pharmaceuticals, gefinancierd door het ERA Cobiotech- programma. Meer informatie: www.comrades-cobiotech.com.
Het Hé-project was een samenwerkingsverband tussen TU Delft, ECUST Shanghai, Guoija, DSM en Centrient Pharmaceuticals, gefinancierd door NWO en het Chinese ministerie voor Wetenschap & Technologie.

Succesvol opschalen van lab naar productie